做外泌体,找宇玫博。做miRNA,如何找靶基因?

2019-09-19

有位道友说,国家给了两个多亿的外泌体课题经费,真心觉得外泌体这块云彩要下雨了,彩虹要出现了,外泌体已经成为当仁不让的热门研究,小编连连点头。虽然很多人都知道做外泌体,找宇玫博;也有很多人知道外泌体中富集miRNA,下游的miRNA-靶基因验证研究是必不可少的实验之一;但是,您知道做miRNA,如何找靶基因吗?小编今天就偷偷把技术支持的miRNA与靶基因结合预测的SOP拿出来给各位客户大大分享一下,让您分分钟学会!

我们以hsa-miR-218-5p与人DISC1预测为例:


步骤1:查找miRNA信息,网站:http://www.mirbase.org/  输入hsa-miR-218-5p,点击“go”

                                               



点击进入查看详情:



获取序列:


>hsa-miR-218-5p MIMAT0000275

UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU


步骤2:查找靶基因mRNA信息


网站:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/


下载mRNA序列,找到3 UTR区序列:


>DISC1 3UTR

ggagtgacgggatgggggagggaggtgggccaccatgtttggacccggggggctgctcttccctcccccgccatagctaagatgcctgaatcaattacggagatacagagccttgaggtctttcagtggaaaggtggttcatgttcattctcatcagtgtgaaactgaggagtctgcaatttggaatatggagagagagactgatttgctgaatttccttctaaatgtcactcaaaaatttcttttccatgtcattcttgggaatgtcttccacaggatttgagaatagtttcatctcagcccccattagagagaagttggggtgaattctggaaaaatgtctctttttcctgtgccatttgccttctgctgcaacgaaaatatttcctgattcaagattctataaaaaggaaaccaagcataagactctgtcatcatacctgttacacgttcctacaggtgcacaatctaagagagctaattaacctcagagtctggagttaacagcttttcaccttacttctcctgtgatctaatattatcttagaaaaattaatatgcaatttccaaaagatattttggtaagacaacaacctcccagtgatatgccacctttcaattttccttttgtggcaatgattgcatctgaagaaaggatccctgagagtctctgtttcatcaggacattctgaaatttacccacagtgaggctgtggatggatcaggggacctgtataaaatgtttgagcctgttccattttcccgtggaacctgtttcactcaatgccaggcagtgcagcatttaggaaagcagtgcagtactcagtaaggcagtgcagtactcagtaacacaatacagtactcaggcagtgcagtactcagtaagacagtgcagtgctcagtaaggcagtgcaatactcagtaacagtgtagtactcagtaacagtgaagtactcagtaatacagtacagtattcagtaaggcagtgaagtactcagtaatacaatacagtactcagttaggcagtgcagtactcaggaatgcagcacagtactcaggcagtgcaatactcagtgcggtactcagtaacacagtgcagtactcagtaacagtgcagtactcagtaacagtgcagtactcagtaaggcagtgcagtactcagtaacacagtgcagtactcagtaatacagtacagtactcagtaaggcagtatggtactcagtaaagcaatgcaatgctcagtaacacagtgcagtgctcaataaggcagtgcagtgctcagtaaggcagtgaattgcttagtaacacagtgtagtgctcagtaggacagcatagtactcagtaacacagggcagctagtactcagtactataagtactgagtacttatataggcaatgtagtactcagtaaatcagtgcagtactcagtaatgcaagggcatttcaggctcctgctgggctgcttctttggcccagctgggactcctattgagacagctgcaaaacaggctgatttcaattaggcagcacttcccaaagtgcactgaggaaggtggccccaagagaagctctctaaacaaaggagtaccctctctggtcaagtacctttggtaaatacaccataccataatatctgcttggagaaccacaatgcacattagcatattagtctgagagagaacttatagtaaggaaactcacttgattttatctaacctcaaactttccaagtttaatggatcgtgaatttttttcatgtaactcctattcatatcccatagatctagtattgtacagcactgcattctctgaggaagtcccagtccaaactctgatttacatcactttagaaaccacactcacacttttgcagagtgttgagcttaataactacctgccacagattggtaaatttaatccagtggttgttctgtttgtgcttctgttctcatttatgtgtttagggatagtgaggttcctgccttcactaggatccacggatatgagaccatttttgtcatttcctgaagtcacactggcgtttccagaaggcatctggtgctttgctcagccttccatgctgtgcagcacttctgtcctcagtcaaggagatggccatgcttaagccagcaattggctggggtccaggaaacaaagcaaaagcacaatatgtgaatgtgctgattgtgttccctatggctttatctcgagcaaaatacactctacatattttaataataagtataattagcttgttcctggacttcattttcaatgatgaaccaaattcctgaattatttataattgtgtctaaagaaaattatgaactggtcacatggcacttggaatccttgagttaattccagtgaagcaaaacttgggaagagtcaggattggccacattgccaataacaaattcctacttcgacatatgtcttttcaaaaagcctcccagacacaagacatcttaaccgtcactagcccaagtgttttgtattactcagacaccatcatgaaataattctgtgaggtcatgatgtatttgaaaattctgcaagttaataactgccttgaattgtttgaacccgaaataagggttctttggtacctctagtagatagtgtgttcatttccctgctgcaaattttgaagtatttgggcaggtgagtcatgttttaaccacaagccataactcatctgttgtctttgcttggtcttagagtatcattcagaaagtccgctaagggccagcgtgcttcttctggctacacaaccttctcaggacaagcccactgtcttaagccactttgaccctgggagacacaggactgtgtatcctcaatcatactatacagcagtttttgtcaggggaacataaaaatatccaagagaggttagggcttagatttaaaagcatcaaaacaacaacaatggaaatttatgttggcgatagccaagaccacaagcaaaagcacatactggaaatgatgagttagaatctgatttgactgggatgttttatgagaatgtaagtgtgatattatactgtctgccttgctggaatgctggctttcaaatggtcacccatttttctttcactggcctgagttaggacatgctatcagtaatagtcccagttccatccaactttctgaaatttcatttttttttttgagatggagtctctctctgtcacccaagttggagtgcagtggccccgcaatctcggctcactgcaacctctacctcccaggttcaagctattctactgcctcagcctcccaagtagctggggttacaggcatttgccaccgggccctgatgatttttgtatttttagtagagacagggcttcaccatgttggctaggagggtctcaaactcctgacctcaggcgatccacccccacctcggcttcccaaagtgctgagattacaggtgtgagccaccgcacccggccaactttctgaaatttcaaaactgaattgatccttctccaaattagtatatactattggaaacttgtctttccctgcagtaaggctggtttccccaccccagaaacatgtaacggttggtaccatgctaagcccttgccatgctaagccctttacagtcatatcctataatccccatatcaaccttataaggaaggtgtttgtagatgatgcaactgagccttaagaggactaattccctttttctaaggcacagagctggtaaaatgtgaagtaatagtgaacctaacagtcagagacaggcagcatgctcttaactagtgctcttcctaaagttcctttaatgtccttttgagattttgagccatggaacttacttgttcacctggctaagaactcatggccactgtggaaatcttggttagggagtcaaagaaactgagcctggggcaaacgaggcttcccacactgccaggggagcctcactgtgaagtctaggctcagacaggcatcaacaaacctattcaccccaccatcatcctgatctaaccattccccagtcatcccaggaaaaccactcacagcctgacactgggctgactttcttgaagatcctcatccaattggtgtttttcagaagtgttccaatattatgaattctgtgttgtggagaaaagcaaccatgcatttactggtcaatgccttcttgtatatgtaattcaatacttttacttttaatatcctcaccttatctaatctttgaattttgtcatgtaatttattgcttcattaaggttactttttgttatacaaaataaaagctgatatccaaggcatggtgcatcttgatgattttttgtcctttgaagtatggatgatagaaaaatgtatcaggtttattcatctcatctttctgttacaggatgattaattgtacagttacatcacacgaaacatttataataaagtcatgctttagaaaaaaaaaaaa

 

步骤3:预测


预测网站:


1、 http://mirdb.org

2、 http://34.236.212.39/microrna/home.do

3、 http://www.targetscan.org/vert_71/

4、 https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid?id=rnahybrid_view_submission


网站1:http://mirdb.org


输入microRNA或者靶基因



无结果


网站2:http://34.236.212.39/microrna/home.do


网站3:http://www.targetscan.org/vert_71/


输入miRNA或者靶基因:



无结果


网站4:https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid?id=rnahybrid_view_submission


输入基因3UTR序列及miRNA序列(注意格式)



点击“next”,继续点击“next”,再点击“start calculcation”,得到预测结果:



步骤4:分析结合域:


核心结合区域:tgtggatggatcagggga


突变后结合域:tCACCaACCaAcaCCgCa


步骤5:构建,通常构建结合域上下游360 bp


> DISC1_3UTR_Wildtype  360bp

Cttagaaaaattaatatgcaatttccaaaagatattttggtaagacaacaacctcccagtgatatgccacctttcaattttccttttgtggcaatgattgcatctgaagaaaggatccctgagagtctctgtttcatcaggacattctgaaatttacccacagtgaggctgtggatggatcaggggacctgtataaaatgtttgagcctgttccattttcccgtggaacctgtttcactcaatgccaggcagtgcagcatttaggaaagcagtgcagtactcagtaaggcagtgcagtactcagtaacacaatacagtactcaggcagtgcagtactcagtaagacagtgcagtgctcag

                                  

> DISC1_3UTR_mutant    360bp

cttagaaaaattaatatgcaatttccaaaagatattttggtaagacaacaacctcccagtgatatgccacctttcaattttccttttgtggcaatgattgcatctgaagaaaggatccctgagagtctctgtttcatcaggacattctgaaatttacccacagtgaggctCACCaACCaAcaCCgCacctgtataaaatgtttgagcctgttccattttcccgtggaacctgtttcactcaatgccaggcagtgcagcatttaggaaagcagtgcagtactcagtaaggcagtgcagtactcagtaacacaatacagtactcaggcagtgcagtactcagtaagacagtgcagtgctcag


构建载体:载体信息pmirGLO



构建方案: 将3UTR和3UTR-mutant分别构建到pmirGLO的MCS位点处,构建成为Luc-3UTR和Luc-3UTR mutant


参考文献:


Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells. Cell. 2009 Aug 7;138(3):592-603. doi: 10.1016/j.cell.2009.07.011.


miR-3188 regulates nasopharyngeal carcinoma proliferation and chemosensitivity through a FOXO1-modulated positive feedback loop with mTOR-p-PI3K/AKT-c-JUN. Nat Commun. 2016 Apr 20;7:11309. doi: 10.1038/ncomms11309.


Exosomal microRNA-155-5p from PDLSCs regulated Th17/Treg balance by targeting sirtuin-1 in chronic periodontitis. J Cell Physiol. 2019 Nov;234(11):20662-20674. doi: 10.1002/jcp.28671. Epub 2019 Apr 23.


好了,以上内容就是小编给大家分享的了。如果您有时间可以自己尝试一下,如果没有时间,我们也可以帮您预测。上海宇玫博生物有专门的技术人员和仪器设备做这个事情!